logo_peq

Efecto antagónico de cepas nativas de Trichoderma spp. contra el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix en México

Rómulo García-Velasco1
Anahid Alonso-Bahena1
Grisel Domínguez-Arizmendi1
Sotero Aguilar-Medel1
Martha E. Mora-Herrera1
Barbarita Companioni-González2
1Universidad Autónoma del Estado de México, Centro Universitario Tenancingo. Estado de México. México.
2Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro. Buenavista, Coahuila, México
DOI

RESUMEN

En México, el Estado de México representa el principal productor de Rosa sp. en el país. Las mayores producciones en el cultivo se localizan en la región sur del estado que incluye los municipios de Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas. Sin embargo, la producción de este cultivo se encuentra afectada por la incidencia de Rosellinia necatrix Prill, agente causal de la pudrición blanca de la raíz. El presente trabajo se realizó con el objetivo de determinar el efecto antagónico de cepas nativas de Trichoderma spp. contra el hongo fitopatógeno R. necatrix en el cultivo de la rosa, en la región sur del Estado de México. Se realizó la selección de los cultivos monospóricos del hongo a partir de las cepas nativas obtenidas en las muestras de suelo. Se logró la identificación morfológica y molecular de las cepas nativas, y establecer los mecanismos de acción in vitro. Se obtuvieron dos cepas nativas Trichoderma tomentosum (SS1-6) y Trichoderma barbatum (SS2-5). Los mecanismos de antagonismos evidenciados en ambas cepas fueron competencia, antibiosis por metabolitos volátiles y difusibles. El micoparasitismo sólo se observó en la cepa nativa SS1-6. La cepa SS1-6 obtuvo el mayor porcentaje de inhibición (89 %) respecto a la cepa SS2-5. El efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados se evidenció en las 2 cepas (SS1-6 y SS2-5). Ambas cepas mostraron ser promisorias para su utilización en el control biológico de R. necatrix en el cultivo de la rosa en la región sur del Estado de México.

Palabras clave: control biológico, patógeno, plantas ornamentales, Rosa sp.

Antagonistic effect of native strains of Trichoderma spp. against the phytopathogenic fungus Rosellinia necatrix in Mexico

ABSTRACT

In Mexico, Mexico State represents the main producer of Rosa sp. in the country. The largest productions in the crop are located in the southern region of the state, which includes the municipalities of Tenancingo, Villa Guerrero, and Coatepec Harinas. However, the production of this crop is affected by the incidence of Rosellinia necatrix Prill, the causal agent of white root rot. The present work was carried out to determine the antagonistic effect of native strains of Trichoderma spp. against the phytopathogenic fungus R. necatrix in rose cultivation, in the southern region of the Mexico State. The selection of the monosporic cultures of the fungus was made from the native strains obtained in the collected soil samples. Morphological and molecular identification of the native strains was achieved and in vitro mechanisms of action. Two native strains Trichoderma tomentosum (SS1-6) and Trichoderma barbatum (SS2-5) were obtained. The antagonism mechanisms evidenced in both strains were competition, antibiosis by volatile and diffusible metabolites. Mycoparasitism was only observed in the native strain SS1-6. The SS1-6 strain obtained the highest percentage of inhibition (89 %) concerning the SS2-5 strain. The effect of volatile metabolites with secreted antifungal activity was evidenced in both strains (SS1-6 and SS2-5). Both strains showed promise for their use in the biological control of R. necatrix in rose cultivation in the southern region of Mexico State.

Key words: biological control, pathogens, ornamental plants, Rosa sp.

INTRODUCCIÓN

El cultivo de Rosa sp. representa uno de los principales ornamentales que exporta México. El Estado de México constituye el principal productor de Rosa sp. en el país (SIAVI 2019). Las mayores producciones en el cultivo se localizan en la región sur del estado, que incluye los municipios de Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas (SIAP 2018). Sin embargo, la producción de este cultivo se encuentra afectada por la incidencia de una serie de fitopatógenos en los que se encuentra a Rosellinia necatrix Prill (=Dematophora necatrix (Hart.) Berl.), agente causal de la pudrición blanca de la raíz (García-Velasco et al. 2012, 2017).

Rosellinia sp. constituye un parásito facultativo con un amplio rango de hospederos (García et al. 2005). En alrededor de 170 especies, 63 géneros y 30 familias se ha demostrado sus daños. El patógeno afecta a un gran número de especies leñosas y semileñosas. Se ha encontrado en bulbos y rizomas, pero principalmente en árboles frutales, forestales y plantas ornamentales (Pérez-Jiménez 2006).

Los principales síntomas ocasionados por la enfermedad se presentan en manchones, sobre todo en zonas del suelo con exceso de humedad. Por otra parte, en el suelo se observan raíces invadidas por cordones miceliales blanco algodonoso que se tornan a negro cuando envejece. En la parte aérea las plantas presentan escaso follaje y muerte de ramas. Las hojas muertas pueden permanecer adheridas a las ramas durante largos períodos de tiempo. Sin embargo, en algunas plantas que se encuentran infectadas no se observan síntomas visuales en la parte área. Esto se debe a que la sintomatología de la enfermedad depende de la edad fisiológica de la planta y de la severidad de la enfermedad (García-Velasco et al. 2012).

El principal método de manejo que se utiliza para la pudrición blanca de la raíz lo constituye el control químico. El mismo consiste en realizar aplicaciones preventivas con bromuro de metilo en el suelo. Además, cuando aparecen los primeros síntomas en las plantas se recomienda efectuar aplicaciones de fungicidas sintéticos (García-Velasco et al. 2017, Alonso-Bahena et al. 2018).

El control de esta enfermedad con el uso de agroquímicos resulta costoso y causa serios daños al medio ambiente. Por otro lado, varios autores plantean que este método de control no brinda resultados satisfactorios, por la aparición de resistencia en el patógeno (Schirawski y Perlin 2018, Stringlis et al. 2018, Companioni-González et al. 2019). Por ello, la utilización de microorganismos para el manejo de plagas y enfermedades constituye una alternativa viable para asegurar la producción en el cultivo de forma sana.

Los microorganismos antagonistas se encuentran en el suelo de forma natural y ofrecen varios beneficios para las plantas. Trichoderma se considera como uno de los antagonistas de hongos fitopatógenos más utilizado en la agricultura moderna sustentable (Youseff et al. 2016, Pineda-Insuasti et al. 2017). Sin embargo, esta capacidad como antagonista es altamente variable. Según Mihuta-Grimm y Rowe (1986) de 255 aislamientos obtenidos de diferentes lugares, sólo el 15 % fue efectivo en el control de Rhizoctonia. En este mismo sentido, Arcia (1995) planteó que las cepas nativas de un lugar son más efectivas que las importadas. Martínez-Bolaños et al. (2008) mostraron que la capacidad antagonista depende de la especificidad de la cepa y de sus modos de acción.

Por lo tanto, el éxito en la formulación y comercialización de biopreparados fúngicos mediante la industria biotecnológica para su aplicación en la agricultura requiere de estudios previos en la selección de aislamientos promisorios para el control y del conocimiento de los mecanismos de acción relacionados con dicho control (Pineda-Insuasti et al. 2017).

El presente trabajo se realizó con el objetivo de determinar el efecto antagónico de cepas nativas de Trichoderma spp. contra el hongo fitopatógeno R. necatrix en el cultivo de la rosa, en la región sur del Estado de México.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se desarrolló en el laboratorio de Fitopatología, Centro Universitario Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México, México.

Colecta de muestras de suelo para el aislamiento de cepas nativas de Trichoderma spp.

Se realizó la colecta de muestras de suelo en un bosque de encino deteriorado de San Simonito, Tenancingo, Estado de México, México. Las muestras de suelo se tomaron según la técnica descrita por Guigón-López et al. (2004). Para ello se seleccionaron cinco puntos de muestreo. En la parte de la rizósfera, a una profundidad de 20 cm se tomó una muestra que contenía 200 g de suelo; y en total por los cinco puntos muestreados se colectó 1 kg de suelo. Todas las muestras colectadas se homogenizaron y después se tomó una muestra de 10 g de suelo. Se añadió un volumen de 90 mL de agua destilada estéril y se agitó durante 20 minutos en una placa de agitación Cimarec®. Posterior a este proceso, se realizó una dilución seriada (5 x 1:9 mL). En las tres últimas diluciones se tomó 1 mL, y se añadió en el medio de cultivo selectivo para Trichoderma spp. (Askew y Lang 1993).

Cada una de las siembras se incubó a 28 ± 2 °C, 56 µmol·m-2·s-1 de intensidad luminosa, y con un fotoperíodo de 12 h luz:12 h oscuridad. Se realizaron observaciones de forma diaria para determinar la presencia de crecimiento micelial de Trichoderma spp. Las colonias de este género crecen de forma rápida, y presentan un micelio aéreo hialino algodonoso, según la cepa y el medio de cultivo. Por el reverso de la caja Petri se pueden observar diversas tonalidades de color: amarillo, ámbar, rojizo opaco o amarillo verdoso. Además, estas colonias desprenden un olor característico del género, similar a coco o alcanfor (Gams y Bissett 2002). A partir de las características observadas en el crecimiento de las colonias del hongo, se seleccionaron muestras y se realizaron preparaciones para su observación en un microscopio Carl Zeiss®. Se corroboraron con la clave taxonómica descrita por Barnett y Hunter (1998) y literatura especializada (Gams y Bissett 2002).

Obtención de cultivos monospóricos en las cepas nativas de Trichoderma spp.

Se realizaron cultivos monospóricos a partir de las cepas nativas obtenidas en las muestras de suelo colectadas. Después de los siete días de la incubación y crecimiento del hongo antagonista se realizó el cultivo monospórico. En una colonia del hongo se añadieron 15 mL de agua destilada estéril y con ayuda de un asa de inoculación se dispersaron las esporas del hongo. Seguidamente, se tomó 1 mL de la suspensión de esporas del antagonista; y se transfirió a un tubo de cultivo que contenía 9 mL de agua destilada estéril.

A partir de esta dilución se realizaron diluciones seriadas (6 x 1:9 mL); y de cada tubo de cultivo se tomó 1 mL de la dilución; y se inocularon en una placa de Petri que contenía medio de cultivo agar papa dextrosa (PDA). El cultivo del hongo se incubó durante dos semanas en las condiciones descritas con anterioridad. Cada 24 h se realizaron las observaciones visuales en el crecimiento micelial de las cepas nativas. Seguido de la observación del crecimiento micelial del hongo; se procedió a la inoculación de seis colonias monospóricas de mayor tamaño a una nueva placa Petri que contenía medio de cultivo PDA. Después del proceso de inoculación, cada 24 h se procedió a trazar el crecimiento radial del hongo hasta que al menos una cubrió por completo el cultivo del antagonista en la placa Petri. Se determinó el área de crecimiento micelial del hongo mediante el programa ImageJ 1.43 (Schneider et al. 2012).

Los datos se analizaron mediante una regresión lineal simple con el programa InfoStat (Di Rienzo et al. 2017). Por otro lado, en cada cultivo monospórico del antagonista se determinó la concentración de esporas del hongo. El conteo de esporas se realizó mediante una cámara de Neubauer (Celeromics, Valencia, España). La selección de los cultivos monospóricos del hongo se realizó teniendo en cuenta los mayores valores en el área de crecimiento micelial y la concentración de esporas del hongo antagonista en las cepas nativas.

Identificación morfológica del género de las cepas nativas

La identificación morfológica del género de las cepas nativas se realizó mediante la clave taxonómica descrita por Gams y Bissett (2002). Para ello se utilizó la técnica de microcultivos del hongo (Ramírez et al. 2015). Se colocó en el interior de una caja Petri un papel absorbente y un triángulo de aluminio. Por último; se colocó un porta objeto y un disco de 8 mm de diámetro de medio de cultivo PDA.

Luego, se inoculó en uno de los extremos del disco del medio de cultivo PDA la cepa nativa del antagonista. Se añadió agua glicerinada al 5 % en el papel absorbente; y se procedió a la incubación de los microcultivos para ambas cepas nativas. Las observaciones en el crecimiento micelial de los microcultivos se realizaron de forma diaria.

Tres días después del proceso de inoculación e incubación del hongo se procedió a separar de forma cuidadosa el porta objeto, con el interés de no dañar el desarrollo del hongo adherido a la superficie del porta objeto. Por otro lado, se colocó la muestra en un portaobjetos con azul de algodón; y se observaron en un microscopio Carl Zeiss®; con el objetivo de realizar la identificación morfológica del género de las cepas nativas.

Identificación molecular de las especies de las cepas nativas de Trichoderma spp.

Las cepas nativas obtenidas SS1-6 y SS2-5 se cultivaron en medio de cultivo PDA. Luego de siete días de incubación se tomó una pequeña porción del crecimiento micelial del hongo en ambas cepas nativas. Se procedió al proceso de extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) mediante el kit de extracción AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Axygen®. Se usaron los cebadores universales ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC e ITS5: GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG (White et al. 1990) para la amplificación mediante PCR de las regiones internas ITS4 e ITS5 de los genes 18S–5.8S y 5.8S–28S.

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador profesional estándar, Biometra®, Alemania. La mezcla de amplificación estuvo compuesta por Taq DNA Buffer PCR 1X; MgCl2 0,75 mM; dNTP’s 0,2 mM; Platinum Taq DNA polymerase 1U (Invitrogen , USA); 10 µM de cada cebador (ITS4-ITS5) y 80 ng de ADN total, en un volumen final de 25 µL para cada reacción.

El programa de amplificación consistió en una fase de desnaturalización inicial con temperatura de 96 °C durante 3 minutos. Luego, una fase de 35 ciclos con temperaturas de: 95 °C durante 30 segundos; 55 °C por 30 segundos y 72 °C durante 45 segundos. Seguida de una fase de extensión final con temperatura de 72 °C por 4 minutos.

Los productos de amplificación se verificaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 %. La tinción se realizó con bromuro de etidio (5 mg·L-1) y los geles se visualizaron en un fotodocumentador Gel Doc, Bio-Rad®, USA.

Los productos amplificados fueron secuenciados en ambas direcciones (5' → 3 'y 3'→ 5') por la compañía Macrogen, en Corea. Las secuencias obtenidas se editaron con el programa BioEdit versión 7.0.0 (Hall 1999) y se alinearon con la base de datos del GenBank del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI 2019).

Determinación de los mecanismos de acción in vitro de Trichoderma spp. contra el hongo fitopatógeno R. necatrix

Cepas patogénicas

En la experimentación se utilizó la cepa patogénica de R. necatrix (VG2GR) procedente del cepario del Laboratorio de Fitopatología del Centro Universitarios de Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México, México. La misma se aisló de plantas enfermas en el cultivo de Rosa sp., en el municipio de Tenancingo, Estado de México, México. La cepa patogénica de R. necatrix (VG2GR); y las cepas nativas de Trichoderma spp. (SS1-6 y SS2-5) se sembraron en medio de cultivo PDA. Después de siete días del proceso de crecimiento e incubación de los hongos descritos se procedió a realizar los siguientes ensayos de mecanismos de acción in vitro de Trichoderma spp. contra R. necatrix.

Competencia

La competencia entre los microorganismos (patógeno-antagonista) se determinó mediante cultivos duales en cajas Petri que contenían medio de cultivo PDA (Bell et al. 1982). Para ello, se tomaron discos de 8 mm de diámetro en ambos hongos (patógeno-antagonista). Estos se sembraron en los extremos de la caja Petri a una separación de 6 cm entre ellos. Luego se incubaron según las condiciones mencionadas.

Las observaciones en el crecimiento de ambos grupos de microorganismos se realizaron de forma diaria. A los quince días después del proceso de incubación se determinó la clasificación de antagonismo por medio del pictograma propuesto por Bell et al. (1982), modificado por Ruiz (2011). Se trazó el área de crecimiento micelial del patógeno para determinar el área de inhibición del crecimiento antagónico. Para ello se tomaron imágenes del reverso de la caja de Petri; y se utilizó el programa ImageJ 1.43 (Schneider et al. 2012).

Antibiosis por metabolitos volátiles

El efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. se determinó mediante la técnica de cajas Petri superpuestas (Allori et al. 2014). Para ello se sembraron disco de 8 mm de diámetro de ambos grupos de hongos de forma independiente en cajas de Petri. Se confrontaron ambos grupos de microorganismos donde se acercaron las dos bases de las cajas Petri inoculadas con los hongos, separadas con papel celofán estéril. Luego, se sellaron e incubaron en las condiciones descritas. Cada 24 h, después del proceso de incubación se determinó el área de crecimiento micelial del patógeno mediante el programa ImageJ 1.43 (Schneider et al. 2012).

Antibiosis por metabolitos difusibles

El efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. se determinó mediante la técnica de papel celofán (Dennise y Webster 1971). Esta consistió en colocar el papel celofán estéril sobre el medio de cultivo PDA. Posterior a ello, se colocó encima un disco de 8 mm de diámetro de la cepa nativa de Trichoderma spp. a ensayar en la prueba de antibiosis y se incubaron en las condiciones mencionadas con anterioridad. Luego de 48 h, se eliminó el papel celofán que contenía el disco del hongo antagonista y se procedió a inocular a R. necatrix. La incubación del cultivo de los hongos se realizó en las condiciones descritas. Cada 24 h, después del proceso de incubación se determinó el área de crecimiento micelial del patógeno mediante el programa ImageJ 1.43 (Schneider et al. 2012).

Micoparasitismo

Para determinar el micoparasitismo de las cepas nativas de Trichoderma spp. sobre el patógeno se utilizó la técnica de microcultivos (Ramírez et al. 2015). A las 72 h del proceso de inoculación e incubación de ambos hongos (patógeno-antagonista) en el interior de la placa Petri se tomaron imágenes mediante una cámara fotográfica (CANON) integrada a un microscopio Carl Zeiss®.

Se consideró como micoparasitismo cuando el micelio de las cepas del antagonista se encontró en contacto o adherido al micelio del patógeno, en enrollamiento, en lisis de las paredes celulares del patógeno y/o haustorios del hongo antagonista en las hifas del patógeno (Howell 2003).

Diseño experimental y análisis estadístico

En toda la experimentación se utilizó un diseño completo al azar, donde cada tratamiento incluyó siete repeticiones. En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario estadístico InfoStat (Di Rienzo et al. 2017). En la generalidad de los experimentos se realizaron pruebas paramétricas: ANOVA y LSD. La probabilidad máxima de cometer error de tipo I fue 0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Obtención de cultivos monospóricos en las cepas nativas de Trichoderma spp.

En las muestras de suelo colectadas se encontraron dos cepas nativas (SS1 y SS2) de Trichoderma spp. En la cepa nativa SS1 se seleccionó el cultivo monospórico SS1-6 como el cultivo que presentó la mayor área de crecimiento micelial (13,992 cm2) y mayor concentración de esporas (3,1 x 107 conidios·mL-1) con marcadas diferencias significativas respecto al resto de los cultivos monospóricos obtenidos en la cepa SS1.

Sin embargo, en la cepa SS2 se seleccionó el cultivo monospórico SS2-5. El cual mostró la mayor concentración de esporas (2,8 x 106 conidios·mL-1) y 10,481 cm2 en su área de crecimiento micelial del hongo antagonista; con diferencias significativas con el resto de los cultivos obtenidos en la cepa SS2 (Cuadro 1).

Cuadro 1.- Determinación del área de crecimiento y la concentración de esporas del hongo antagonista
en las cepas nativas de Trichoderma spp.
Cultivos monospóricos de las cepas nativas Área del crecimiento micelial del antagonista (cm2) Concentración de esporas del antagonista (conidios·mL-1)
SS1-1 10,915 2,2 x 107
SS1-2 11,456 3,2 x 107
SS1-3 13,544 1,8 x 107
SS1-4 13,328 2,6 x 107
SS1-5 11,108 1,3 x 107
SS1-6* 13,992 3,1 x 107
SS2-1 10,677 1,7 x 106
SS2-2 10,488 1,5 x 106
SS2-3 10,447 1,8 x 106
SS2-4 10,473 2,2 x 106
SS2-5* 10,481 2,8 x 106
SS2-6 11,106 2,1 x 106
* cultivos monospóricos seleccionados en las cepas nativas de Trichoderma spp.

Por otro lado, de forma visual se observaron diferencias cualitativas en el crecimiento micelial en ambas cepas crecidas en el medio de cultivo PDA. En la cepa SS1-6 se observó la presencia de colonias con micelio blanco algodonoso y compacto a medida de la edad del cultivo del hongo; y la presencia de tonalidades verdosas con apariencia de anillos concéntricos como resultado de la producción de conidios (Figura 1-A). Además, se apreció una pigmentación amarillenta (Figura 1-B). Sin embargo, en la cepa SS2-5 se observó un crecimiento micelial en forma de anillos concéntricos y grumos donde se agrupan los conidios (Figura 2-A) y una pigmentación blanca (Figura 2-B).

trichoderma
Figura 1. Cultivo monospórico de la cepa nativa de Trichoderma spp. SS1-6. A: anverso de la placa; B: reverso de la placa
trichoderma
Figura 2. Cultivo monospórico de la cepa nativa de Trichoderma spp. SS2-5. A: anverso de la placa; B: reverso de la placa

En este sentido, Ibarra-Medina et al. (2010) con el interés de obtener microorganismos potenciales para el control de Sclerotinia sclerotiorum y Sclerotinia minor realizaron el aislamiento de cepas de Trichoderma a partir de muestras de suelo. Mediante la técnica de trampas con esclerocios obtuvieron setenta y un aislados fúngicos de Trichoderma. Seguidamente, evaluaron su capacidad micoparasítica sobre el micelio; y esclerocios de ambos patógenos.

Por otro lado, Samaniego-Fernández et al. (2018) describen el uso de trampas a base de arroz cocido o de forma directa en el medio de cultivo PDA para el aislamiento, identificación y evaluación de cepas autóctonas de Trichoderma spp. Para ello determinaron el crecimiento lineal diario (radios de las colonias), la velocidad de crecimiento y el porcentaje de inhibición del crecimiento radial de los antagonistas. Las cepas autóctonas de Trichoderma aisladas e identificadas fueron Trichoderma 2T-aislado, T. harzianum 6(A-53)2 y T. viride 4(TS-3)1. Trichoderma 2T-aislado resultó el antagonista in vitro más eficiente contra los hongos fitopatógenos Rhizoctonia solani Kühn, Fusarium spp. y Sclerotium rolfsii Sacc. Seguida de T. viride 4(TS-3)1 (biocontrolador de R. solani y S. rolfsii; y con menor capacidad antagónica contra Fusarium spp.) y T. harzianum 6(A-53)2.

Mientras que Herrera-Jiménez et al. (2018) obtuvieron un aislamiento de T. tomentosum a partir de raíces de plantas de maíz; el cual mostró efecto de estimulación del crecimiento en el cultivo.

Identificación morfológica del género de las cepas nativas

Las características encontradas en ambas cepas nativas (SS1-6 y SS2-5) corresponden con las planteadas por otros autores para el género Trichoderma spp. En ambas cepas se observaron las siguientes características morfológicas: micelio septado con pigmentación de color verde; conidióforos ramificados; fiálides en forma de botella y verticiladas; y conidios ovalados de color verde (Figura 3 A y B). En la cepa nativa SS1-6 se obtuvo que los conidios resultaron en promedio 0,232 µm de largo y 0,161 µm de ancho. El largo de las fiálides fue de 1,263 µm, con una base de 0,124 µm. Por otro lado, los conidios en la cepa SS2-5 midieron en promedio 0,31 µm de largo y 0,149 µm de ancho. Las fiálides 0,787 µm de largo y 0,250 µm en su base (Cuadro 2). Guigón-López et al. (2010) determinaron que seis cepas nativas seleccionadas morfológicamente fueron similares a T. harzianum y a T. viride. Las cepas nativas TC74, TC74M y T341 desarrollaron colonias cuyas características, en conjunto con el patrón de ramificación y morfología de los conidióforos, color y forma de los conidios fueron similares a las características de T. harzianum. Mientras que las cepas T359 y T479 mostraron características similares a las descritas para T. viride.
fiálides Trichoderma
Figura 3. Identificación morfológica de las cepas nativas de Trichoderma spp.
Micelio septado (m), conidióforos (cn), fiálides (f) y conidios (c).
(A) Cepa nativa SS1-6 y (B) cepa nativa SS2-5, 100x.
Cuadro 2.- Identificación morfológica de las cepas nativas de Trichoderma spp.
Cepas nativas Conidios
Largo (µm) Ancho (µm)
Máximo Mínimo X–* Máximo Mínimo X–*
SS1-6 0,35 0,09 0,232 0,24 0,04 0,161
SS2-5 0,65 0,12 0,31 0,36 0,06 0,149
Cepas nativas Fiálides
Largo (µm) Bases (µm)
Máximo Mínimo X–* Máximo Mínimo X–*
SS1-6 1,76 0,86 1,263 0,25 0,06 0,124
SS2-5 1,84 0,3 0,787 0,79 0,08 0,25
* promedio de 30 estructuras de las cepas nativas de Trichoderma spp.

Identificación molecular de las cepas nativas de Trichoderma spp. a nivel de especie

Las secuencias de nucleótidos obtenidas y alineadas mediante la base de datos GenBank (NCBI 2019) mostraron que las cepas nativas obtenidas pertenecen a dos especies del género Trichoderma spp. La cepa SS1-6 se alineó con el aislamiento con número de acceso KR995108.1 correspondiente a T. tomentosum Bissett. La cepa SS2-5 se alineó con el aislamiento con el código de acceso MH863657.1 con 100 % correspondiente a T. barbatum Samuels (Cuadro 3). En la actualidad existen alrededor de 348 especies de este género (COL 2018). Sin embargo, su utilización como agentes para el control biológico de enfermedades se limitan para pocas especies entre ellas encontramos: T. harzianum, T. asperellum, T. viridae, T. hamantum, T. reesei y T. koningii (Martínez et al. 2013, Duarte-Leal et al. 2018).

Cuadro 3.- Identificación molecular de las cepas nativas de Trichoderma spp., alineadas con especies mantenidas en el GenBank.
Cepas nativas Cebadores Nucleótidos (#) Especies identificadas Número de acceso GenBank Similitud (%) Datos de las accesiones
Hospedero / sustrato Origen geográfico
SS1-6 ITS4 571 T. tomentosum KR995108.1 100 Colección Lituania
ITS5 571 T. tomentosum KR995108.1 100 - -
SS2-5 ITS4 574 T. barbatum MH863657.1 99,83 raíz de Fragaria sp. Michigan USA
ITS5 573 T. barbatum MH863657.1 100 - -

En la actualidad se encuentran pocos estudios relacionados con el uso de las especies T. tomentosum y T. barbatum como agentes biológicos en plantas. Herrera-Jiménez et al. (2018) compararon el efecto de dos cepas de Trichoderma (T. tomentosum: EMMFRS1C2 y T. harzianum: MichV6S3C2) productoras de indol con respecto a la aplicación de dos fitohormonas exógenas IAA (ácido indolacético) e IBA (ácido indol-3-butírico) en el crecimiento de plantas de maíz. Según los parámetros evaluados tales como altura, longitud de la raíz, área de la hoja, raíz, tallo y peso seco total, las mejores respuestas de crecimiento en las plantas se lograron en las plantas inoculadas con conidios de las cepas de T. tomentosum (EMMFRS1C2) y T. harzianum (MichV6S3C2). En otro estudio realizado por Hicks et al. (2014) demostraron que T. barbatum inhibe la enfermedad causada por Rhizoctonia en el cultivo de papa (Solanum tuberosum Bert. ex Walp.) en condiciones controladas. A su vez promueve el crecimiento y desarrollo de las plantas.

Determinación de los mecanismos de acción in vitro de Trichoderma spp. contra el hongo fitopatógeno R. necatrix

Competencia

En el crecimiento antagónico de las cepas nativas de Trichoderma spp. en el cultivo dual con R. necatrix se observó que ambas cepas (SS1-6 y SS2-5) lograron su primer contacto con el patógeno a partir del tercer y cuarto día, después del proceso de inoculación e incubación del cultivo dual. No se observaron diferencias significativas entre ambos tratamientos (Figura 4).

crecimiento antagónico <i>Trichoderma</i>
Figura 4. Crecimiento antagónico de las cepas nativas de Trichoderma spp. en el cultivo dual con Rosellinia necatrix. Medias con letras iguales indican que no existe diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, LSD: P>0,05).

Sin embargo, según la clasificación de antagonismo descrito por Ruíz (2011), la cepa SS1-6 se clasifica en la clase 1, con marcadas diferencias respecto a la cepa SS2-5. Por otra parte, en la cepa SS1-6 se obtuvieron los mayores valores en el área de intersección del hongo antagonista (5,51 cm2). Se logró la menor área de crecimiento micelial del patógeno (5,51 cm2) y un porcentaje de inhibición de 89 %, con diferencias significativas en relación a la cepa SS2-5 y con el tratamiento control (Cuadro 4).

Cuadro 4.- Área de crecimiento micelial de Rosellinia necatrix en cultivos duales con Trichoderma spp.,
después de 15 días de inoculación de ambos microorganismos.
Cepas nativas Clasificación de
antagonismo		 Área de
intersección (cm2)		 Área de crecimiento
micelial (cm2)		 Inhibición (%)*
SS1-6 1a 5,51a 5,51a 89,0
SS2-5 4,29b 8,88a 15,27b 69,3
Testigo No aplica No aplica 49,81c No aplica
: cifras con diferente literal indican diferencias estadísticas significativas. * respecto al testigo. Medias con letras iguales indican que no existe diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, LSD: P>0,05).

Trichoderma spp. presenta distintos mecanismos de acción para ejercer su antagonismo. Lo cual depende de las características de la cepa, del patógeno; y de las condiciones ambientales. Puede actuar por medio de competencia, antibiosis, micoparasitismo, inducción de resistencia sistémica y estimulación de crecimiento vegetal (Waghunde et al. 2016). En este sentido, Alonso et al. (2018) aislaron cepas nativas de Trichoderma spp., y probaron el efecto in vitro frente a R. necatrix y Verticillium dahlia. Ambos, organismos patógenos importantes en el cultivo de rosa (Rosa spp.), en la región florícola del sur del Estado de México. En dicho estudio determinaron el grado de competencia por medio de cultivo dual y metabolitos volátiles de las diferentes cepas de Trichoderma spp. (SS1, SS2, y Cu-B).

Los resultados mostraron que las cepas SS1 y Cu-B en el cultivo dual presentaron los mayores porcentajes de inhibición respecto a ambos agentes patógenos. Sin embargo, en el efecto de metabolitos volátiles las cepas SS2 y Cu-B alcanzaron los mejores porcentajes de inhibición con respecto a los hongos fitopatógenos evaluados. Ello indicó que las cepas de Trichoderma presentan diferentes mecanismos de acción in vitro. Estos resultados evidencian la importancia de realizar estudios previos para la selección de la cepa según su especificidad y mecanismo de acción con la finalidad de garantizar el éxito en la formulación y su posterior aplicación en campo.

Por otro lado, Sanabria y Graboswski (2016) evaluaron el efecto de aislados nativos de Trichoderma spp. para el control del patógeno radicular Rosellinia sp., en condiciones in vitro y ex vitro, en el cultivo de macadamia (Macadamia integrifolia Maiden y Betche). En condiciones in vitro los aislados nativos de Trichoderma spp. obtenidos de diferentes parcelas productoras de macadamia presentaron diferencias en cuanto a la velocidad de crecimiento; el grado de sobreposición micelial; y su capacidad de inhibición de crecimiento in vitro de Rosellinia sp. Los aislados seleccionados de Trichoderma spp. que presentaron mayor potencial antagónico contra Rosellinia sp. fueron: GS13, GS18, GS10, GS8, GS4, GS1, GS11, GS6, GS19, GS2, GS15, GS9, GS14, GS12, GS7, GS4 y GS3. La inhibición en el crecimiento in vitro para este patógeno se logró en un intervalo de 42,8 a 80,2 %.

Antibiosis por metabolitos volátiles

El efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. se evidenció en ambas cepas (SS1-6 y SS2-5) con marcadas diferencias respecto al tratamiento control. El mayor porcentaje de inhibición se logró en la cepa SS2-5 (48,3 %) (Cuadro 5). Qualhato et al. (2013) evaluaron el antagonismo y la producción de enzimas hidrolíticas de cuatro especies de Trichoderma contra varios patógenos de plantas entre ellos: Fusarium solani, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum. Los resultaros mostraron que las especies T. harzianum y T. asperellum fueron los antagonistas más efectivos contra los patógenos de plantas probados.

Cuadro 5.- Efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp.
Cepas nativas Área de crecimiento micelial
del patógeno (cm2)		 Inhibición (%)*
SS1-6 21,41a 45,7
SS2-5 20,36a 48,3
Testigo 39,4b No aplica
: cifras con diferente literal indican diferencias estadísticas significativas. * respecto al testigo. Medias con letras iguales indican que no existe diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, LSD: P>0,05).

Por otra parte, la mayoría de las especies de Trichoderma probadas produjeron metabolitos volátiles tóxicos con efectos significativos en la inhibición del crecimiento y desarrollo de los patógenos vegetales mencionados. Arjona-Girona et al. (2014) determinaron el efecto de metabolitos de diferentes cepas de Trichoderma spp. sobre el crecimiento de R. necatrix, agente causal de la pudrición de la raíz blanca en el aguacate. Los resultaron demostraron que los metabolitos secundarios 6PP (6-pentyl-α-pyrone), cerinolactona (3-hidroxi-5-(6-isopropil-3-metilen-3,4,4a,5,6,7,8,8a-octahidronaftalen-2-il) dihidrofuran-2-ona) y T39 butenólido (4-hexa-2,4-dienil-3-(2-oxo-propil)-5H-furan-2-ona) de la cepa T. atroviride presentaron elevada efectividad contra R. necatrix inhibiendo entre el 25 y 91 % de crecimiento micelial del patógeno.

Antibiosis por metabolitos difusibles

El efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. no presentó diferencias entre los tratamientos. Sin embargo, se obtuvo el mayor porcentaje de inhibición del patógeno en el tratamiento donde se utilizó la cepa SS2-5 (13,4 %) con diferencias marcada respecto a la cepa SS1-6. Por otra parte, no se encontró efecto de los metabolitos difusibles respecto al porcentaje de estimulación en las cepas nativas estudiadas (Cuadro 6).

Cuadro 6.- Efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp.
Cepas nativas Área de crecimiento
micelial (cm2)		 Inhibición (%)* Estimulación (%)
SS1-6 41,08a 3,54 0
SS2-5 36,89a 13,4 0
Testigo 42.59a No aplica No aplica
: cifras con diferente literal indican diferencias estadísticas significativas. * respecto al testigo. Medias con letras iguales indican que no existe diferencias estadísticamente significativas (ANOVA, LSD: P>0,05).

Las propiedades antagonistas de este hongo se basan en la activación de múltiples mecanismos que también promueven la producción de compuestos y metabolitos específicos que funcionan como factores de crecimiento vegetal, y mejoran su resistencia sistémica frente a las enfermedades en plantas (Hernández-Melchor et al. 2019).

Micoparasitismo

El micoparasitismo del microorganismo antagonista sobre R. necatrix se evidenció sólo en la cepa SS1-6. El micelio de T. tomentosum (cepa SS1-6) se observó enrollando el micelio del patógeno. Igualmente se apreció la lisis celular de R. necatrix (Figura 5). Diferentes estudios indican que el proceso del micoparasitismo constituye el principal mecanismo antagonista mostrado por Trichoderma. Este inicia cuando el hongo antagonista reconoce al hospedador y se une a las hifas por apresorios. Luego, degrada la pared celular secretando enzimas; en especial la quitinasa y la β-1,3-glucanasas, celulasas, proteasas y fosfatasas (Qualhato et al. 2013).

Micopararitismo de T. tometosum en el patógeno
Figura 5. Micoparasitismo de Trichoderma tomentosum en el patógeno.
(a) Micelio de T. tomentosum (SS1-6) enrollando (E) al micelio de R. necatrix (Rn).
(b) Lisis (L) del micelio de R. necatrix (B), 100x.

En los ensayos de confrontamiento Peláez-Álvarez et al. (2016) mostraron la capacidad de T. asperellum (T8a) para inhibir el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides (ATCCMYA456) en un 91 %. Esto a través de mecanismos micoparasíticos observando un sobrecrecimiento en el hongo fitopatógeno por la cepa T8a, evidenciando la capacidad antagonista como alternativa promisoria de control de origen microbiano contra el agente causal de la antracnosis en el mango (de los Santos-Villalobos et al. 2013).

Martínez-Martínez et al. (2020), en las cepas T1 y T2 de T. harzianum demostraron microscópicamente los mecanismos de micoparasitismo sobre ocho cepas de fitopatógenos. Por lo general se observó enrrollamiento, penetración y vacuolización. El comportamiento micoparasítico observado en la cepa SS1-6 ha sido evidenciado para el género Trichoderma (estado teleomorfo: Hypocrea). Esta capacidad para micoparasitar mediante la biosíntesis de enzimas líticas se ha utilizado de forma amplia para la protección de plantas contra diversas enfermedades fúngicas (Atanasova et al. 2013).

CONCLUSIONES

Se obtuvieron dos cepas nativas T. tomentosum (SS1-6) y T. barbatum (SS2-5). Los mecanismos de antagonismos evidenciados por ambos antagonistas fueron competencia, antibiosis por metabolitos volátiles y difusibles. El micoparasitismo sólo se observó en la cepa nativa SS1-6. Se obtuvo el mayor porcentaje de inhibición en la cepa SS1-6.

En ambas cepas se evidenció efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados. El efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por el antagonista se logró mayor porcentaje de inhibición del patógeno con la cepa SS2-5. Ambas cepas mostraron ser promisorias para su utilización en el control de R. necatrix en el cultivo de la rosa en la región sur del Estado de México.

LITERATURA CITADA

  1. Allori-Stazzonelli, E; Yasem, MG; Ploper, LD. 2014. Inhibición de Sclerotinia sclerotiorum por metabolitos volátiles y no volátiles producidos por especies nativas del género Trichoderma (en línea). Revista Agronómica del Noroeste Argentino 34(2):197- 199. Consultado 9 may. 2019. Disponible en https://bit.ly/3vLt9Dl
  2. Alonso, A; López, H; Domínguez, G; García, R. 2018. Actividad antagónica de cepas nativas de Trichoderma spp. sobre Rosellinia necatrix y Verticillium dahlia (en línea). Revista Mexicana de Fitopatología 36(3):S27-S28. Consultado 9 may. 2019. Disponible en https://bit.ly/3cTQEBt
  3. Arcia, A. 1995. Uso de antagonistas en el control de fitopatógenos del suelo. In Control microbial de insectos plagas y enfermedades en cultivos. Universidad Centro Occidental Lisandro Alvarado (UCLA), Barquisimeto, Venezuela. p. 185-204.
  4. Arjona-Girona, I; Vinale, F; Ruano-Rosa, D; Lorito, M; López-Herrera, CJ. 2014. Effect of metabolites from different Trichoderma strains on the growth of Rosellinia necatrix, the causal agent of avocado White root rot (en línea). European Journal of Plant Pathology 140(2):385-397. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/2OIvrm5
  5. Askew, DJ; Lang, MD. 1993. An adapted selective medium for the quantitative isolation of Trichoderma species (en línea). Plant Pathology 42(5):686-690. Consultado 22 oct. 2019. Disponible en https://bit.ly/3vGyOud
  6. Atanasova, L; Le Crom, S; Gruber, S; Coulpier, F; Seidl-Seiboth, V; Kubicek, CP; Druzhinina, IS. 2013. Comparative transcriptomics reveals different strategies of Trichoderma mycoparasitism (en línea). BMC Genomics 14:121. Consultado 18 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/3cORq2x
  7. Barnett, HL; Hunter, BB. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi (4 ed.). Macmillan Publishing Co. New York, EUA. 218 p.
  8. Bell, DK; Wells, HD; Markaham, CR. 1982. In vitro antagonism of Trichoderma species against six fungal plant pathogens (en línea). Phytopathology 72:379-382. Consultado 10 dic. 2019. Disponible en https://bit.ly/3lw0TQe
  9. COL (Catalogue of Life, Netherlands). 2018. Catalogue of life: 2018 Annual Checklist (en línea). Consultado 18 may. 2019 Disponible en https://bit.ly/3lzrbkN
  10. Companioni-González, B; Domínguez-Arizmendi, G; García-Velasco, R. 2019. Trichoderma: su potencial en el desarrollo sostenible de la agricultura (en línea). Revista Biotecnología Vegetal 19(4):237-248. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/3cOvCnD
  11. de los Santos-Villalobos, S; Guzmán-Ortiz, DA; Gómez-Lim, MA; Délano-Frier, JP; de-Folter, S; Sánchez–García, P; Peña-Cabriales, JJ. 2013. Potential use of Trichoderma asperellum (Samuels, Liechfeldt et Nirenberg) T8a as a biological control agent against anthracnose in mango (Mangifera indica L.) (en línea). Biological Control 64(1):37-44. Consultado 7 nov. 2019. Disponible en https://bit.ly/3r2WEgh
  12. Dennise, C; Webster, J. 1971. Antagonistic properties of species groups of Trichoderma: I. Production of volatile antibiotics (en línea). Transaction of the British Mycological Society 57:25-39. Consultado 22 oct. 2018. Disponible en https://bit.ly/3vFEN2q
  13. Di Rienzo, JA; Casanoves, F; Balzarini, MG; González, L; Tablada, M; Robledo, CW. 2017. Infostat (en línea, programa informático). Córdoba, Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Consultado 10 may. 2020. Disponible en https://bit.ly/3l4HBjN
  14. Duarte-Leal, Y; Pozo-Martínez, L; Martínez-Coca, B. 2018. Antagonismo in vitro de cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt & Nirenbergfrente a aislados de Fusarium spp. (en línea). Revista de Protección Vegetal 33(1):1-10. Consultado 9 may. 2020. Disponible en https://bit.ly/2NzkOkJ
  15. Gams, W; Bissett, J. 2002. Basic biology, taxonomy and genetics. In Kubicek, C; Harman, G. (eds.). Trichoderma and Gliocladium Vol. 1. Taylor & Francis p. 3-31. ISBN 0-7484-0572-0. Consultado 13 oct. 2020. Disponible en https://bit.ly/3r9IdHh
  16. García C, J; George, A; Argyle, T; Hoopen, M; Krauss, U. 2005. ¿Existe la tolerancia genética del Cacao (Theobroma cacao) a Rosellinia bunodes y Rosellinia pepo? (en línea). Manejo Integrado de Plagas y Agroecología 75:21-31. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/313twL2
  17. García-Velasco, R; Domínguez-Arismendi, G; Chavarro-Carrero, EA; Mora-Herrera, ME. 2017. Pathogenicity of Verticillium dahliae Klebahn in rootstock rose cv. Manetti (en línea). 2017 APS Anual Meeting, San Antonio, Texas. p.S5-113. Consultado 5 may. 2019. Disponible en https://bit.ly/3sCGiMQ
  18. García-Velasco, R; González-Díaz, JG; Domínguez-Arismendi; G; Ayala-Escobar, V; Aguilar-Medel, S. 2012. Rosellinia necatrix en Rosa sp. y su evaluación a sensibilidad de fungicidas (en línea). Revista Chapingo Serie Horticultura 18(1):39-54. Consultado 11 ago. 2019. Disponible en https://bit.ly/3rZlGhw
  19. Guigón L, C; González G, PA. 2004. Selección de cepas nativas de Trichoderma spp. con actividad antagónica sobre Phytophthora capsici Leonian y promotoras de crecimiento en el cultivo de chile (Capsicum annum L.) (en línea). Revista Mexicana de Fitopatología 22(1):117-124. Consultado 12 oct. 2019. Disponible en https://bit.ly/3s3jDJx
  20. Guigón-López, C; Guerrero-Prieto, V; Vargas-Albores, F; Carvajal-Millán, E; Ávila-Quezada, GD; Bravo-Luna, L; Ruocco, M; Lanzuise, S; Woo, S; Lorito, M. 2010. Identificación molecular de cepas nativas de Trichoderma spp. su tasa de crecimiento in vitro y antagonismo contra hongos fitopatógenos (en línea). Revista Mexicana de Fitopatología 28(2):87-96. Consultado 22 oct. 2019. Disponible en https://bit.ly/3c28TW9
  21. Hall, TA. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium 41:95–98.
  22. Hernández-Melchor, DJ; Ferrera-Cerrato, R; Alarcón, A. 2019. Trichoderma: importancia agrícola, biotecnológica, y sistemas de fermentación para producir biomasa y enzimas de interés industrial (en línea). Chilean Journal of Agricultural and Animal Sciences 35(1):98-112. Consultado 19 oct. 2020. Disponible en https://bit.ly/2OWF801
  23. Herrera-Jiménez, E; Alarcón, A; John, L; Ferrera-Cerrato, R; Cruz-Izquierdo, S; Ferrera-Rodríguez, MR. 2018. Comparative effects of two indole-producing Trichoderma strains and two exogenous phytohormones on the growth of Zea mays L., with or without tryptophan (en línea). Journal of Soil Science and Plant Nutrition 18(1):188-201. Consultado 11 ago. 2019. Disponible en https://bit.ly/3s8NEHE
  24. Hicks, E; Bienkowski, B; Braithwaite, M; Mclean, K; Fallon, R; Stewart, A. 2014. Trichoderma strains suppress Rhizoctonia diseases and promote growth of potato (en línea). Phytopathologia Mediterranea 53(3):502-514. Consultado 11 ago. 2019. Disponible en https://bit.ly/3rD54ez
  25. Howell, CR. 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: The history and evolution of current concepts (en línea). Plant Disease 87(1):4-10. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/3s7PAjz
  26. Ibarra-Medina, VA; Ferrera-Cerrato, R; Alarcón, A; Lara-Hernández, ME; Valdez-Carrasco, JM. 2010. Aislamiento y selección de cepas de Trichoderma antagonistas a Sclerotinia sclerotiorum y Sclerotinia minor (en línea). Revista Mexicana de Micología 31:53-63. Consultado 13 oct. 2020. Disponible en https://bit.ly/2PetLk5
  27. Martínez, B; Infante, D; Reyes, Y. 2013. Trichoderma spp. y su función en el control de plagas en cultivos (en línea). Protección vegetal 28(1):1-11. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/3s4d8pE
  28. Martínez-Bolaños, M; Nieto-Angel, DA; Teliz-Ortiz, D; Rodríguez-Alcázar, J; Martínez-Damian, MT; Vaquera-Huerta, H; Carrillo M, O. 2008. Comparación cualitativa de fresas (Fragaria x ananassa Duch) de cultivares mexicanos y estadounidenses (en línea). Revista Chapingo Serie Horticultura 14(2):113-119. Consultado 2 oct. 2019. Disponible en https://bit.ly/317dpfu
  29. Martínez-Martínez, TO; Guerrero-Aguilar, BZ; Pecina-Quintero, V; Rivas-Valencia, P; González-Pérez, E; Angelez-Núñez, JG. 2020. Trichoderma harzianum antagonism against chickpea fusariosis and its biofertilizing effect (en línea). Revista Mexicana Ciencias Agrícolas 11(5):1135-1147. Consultado 13 oct. 2020. Disponible en https://bit.ly/3r7lFa0
  30. Mihuta-Grimm, L; Rowe, C. 1986. Trichoderma spp. as biocontrol agents of Rhizoctonia damping off of radish in organic soil and comparison of four delivery systems (en línea). Phytopathology 76(3):306-312. Consultado 19 jun. 2019. Disponible en https://bit.ly/3lD30Sr
  31. NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA). 2019. GenBank Resources (en línea, pág web). Consultado 9 may. 2019. Disponible en https://bit.ly/3cYtJFf
  32. Peláez-Álvarez, A; de los Santos-Villalobos, S; Yépez, EA; Parra-Cota, FI; Reyes-Rodríguez, RT. 2016. Efecto sinérgico de Trichoderma asperellum T8A y Captan 50® contra Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) (en línea). Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 7(6):1401-1412. Consultado 9 jun. 2019. Disponible en https://bit.ly/392udZ
  33. Pérez-Jiménez, RM. 2006. A review of the biology and pathogenicity of Rosellinia necatrix - The cause of white root rot disease of fruit frees and other plants (en línea). Journal of Phytopathology 154(5):257-266. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/2P8CPqx
  34. Pineda-Insuasti, JA; Benavides-Sotelo, EN; Duarte-Trujillo, AS; Burgos-Rada, CA; Soto-Arroyave, CP; Pineda-Soto, CA; Fierro-Ramos, FJ; Mora-Muñoz, ES; Álvarez-Ramos, SE. 2017. Producción de biopreparados de Trichoderma spp: una revisión (en línea). ICIDCA sobre los Derivados de la Caña de Azúcar 51(1):47–52. Consultado 11 may. 2018. Disponible en https://bit.ly/31290ui
  35. Qualhato, TF; Lopes, FAC; Steindorff, AS; Brandao, RS; Jesuino, RSA; Ulhoa, CJ. 2013. Mycoparasitism studies of Trichoderma species against three phytopathogenic fungi: evaluation of antagonism and hydrolytic enzyme production (en línea). Biotechnology letters 35(9):1461-1468. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/3s3ZyTh
  36. Ramírez, RM; Urzúa, HMC; Camacho, CA; Tsuzuki, RG; Esquivel, R. 2015. Técnicas básicas de microbiología y su fundamento. Editorial Trillas. México. 375 p.
  37. Ruiz, RA. 2011. Captura, actividad biológica e identificación de volátiles de la interacción Trichoderma asperellum - Sclerotium rolfsii (en línea). Tesis de maestría. Instituto Politécnico Nacional Centro de Desarrollo de Productos Bióticos. Yautepec, México. 81 p. Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/3cVPCVC
  38. Samaniego-Fernández, LM; Harouna, M; Corbea, O; Rondón-Castillo, AJ; Placeres-Espinoza, I. 2018. Aislamiento, identificación y evaluación de cepas autóctonas de Trichoderma spp. antagonistas de patógenos del suelo (en línea). Revista de Protección Vegetal 33(3):1-11. Consultado 9 nov. 2019. Disponible en https://bit.ly/3lAyMPQ
  39. Sanabria, A; Graboswski, C. 2016. Control biológico de Rosellinia sp. causantes de la muerte súbita de macadamia (Macadamia integrifolia) con aislados de Trichoderma spp. (en línea). Investigación Agraria 18(2):77-86. Consultado 5 may. 2020. Disponible en https://bit.ly/3s9F1ga
  40. Schneider, CA; Rasband, WS; Eliceiri, KW. 2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis (en línea). Nature Methods 9:671-675. Consultado 22 oct. 2019 Disponible en https://doi.org/gcwb4q
  41. Schirawski, J; Perlin, MH. 2018. Plant–microbe interaction 2017: The good, the bad and the diverse (en línea). International Journal Molecular Sciences 19(5):1374. Consultado 5 may. 2020. Disponible en https://bit.ly/2Pc8QOD
  42. SIAP (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera, México). 2018. Avance de siembra y cosechas resumen por estado (en línea, pág. web). Consultado 11 ago. 2018. Disponible en https://bit.ly/314S06
  43. SIAVI (Sistema de Información Arancelaria Vía Internet, México). 2019. Sistema de información arancelaria vía internet (en línea, pág. web). Consultado 22 oct. 2019. Disponible en https://bit.ly/3vMXzFi
  44. Stringlis, IA; Zhang, H; Pieterse, CMJ; Bolton, MD; Jonge, R. 2018. Microbial small molecules - weapons of plant subversion (en línea). Natural Product Reports 35:410-433.Consultado 9 may. 2019. Disponible en https://rsc.li/3f2dmtN
  45. Waghunde, RR; Shelake, RM; Sabalpara, AN. 2016. Trichoderma: A significant fungus for agriculture and environment (en línea). African Journal of Agricultural 11(22):1952–1965. Consultado 22 oct. 2019. Disponible en https://bit.ly/3s8ioJ5
  46. White, TJ; Bruns, T; Lee, S; Taylor, J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In Innis, MA; Gelfand, DH; Sninsky, JJ; White, TJ. (eds.). PCR protocols: A guide to methods and applications. San Diego, California, EUA. Academic Press. p. 315-322. Consultado 18 ago. 2020. Disponible en https://bit.ly/3c5ScJb
  47. Youssef, S; Tartoura, K; Abdelraouf, G. 2016. Evaluation of Trichoderma harzianum and Serratia proteamaculans effect on disease suppression, stimulation of ROS-scavenging enzymes and improving tomato growth infected by Rhizoctonia solani (en línea). Biological Control 100:79-86. Consultado 9 may. 2020. Disponible en https://bit.ly/3c8h3fO