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Antagonismo in vitro de cepas nativas de Trichoderma spp. contra Verticillium dahliae y Botryis cinerea en el Estado de México

Rómulo García-Velasco1 Anahid Alonso-Bahena1 Grisel Domínguez-Arizmendi1 Sotero Aguilar-Medel1 Martha E. Mora-Herrera1 Barbarita Companioni-González2
1Universidad Autónoma del Estado de México, Centro Universitario Tenancingo, Tenancingo, Estado de México, México.
2Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Buenavista, Saltillo, Coahuila, México.
DOI

RESUMEN

Rosa sp., constituye un rubro de alta demanda mundial. En México, representa una de las ornamentales de mayor exportación; sin embargo, Verticilium dahliae Kleb., y Botritis cinerea Pers., se encuentran entre los principales hongos fitopatógenos que afectan los rendimientos y la calidad del producto final en el cultivo. En el siguiente trabajo se determinó el antagonismo in vitro, realizado por cepas nativas de Trichoderma spp. procedentes del Estado de México, contra V. dahliae y B. cinerea. Las cepas de Trichoderma spp. en estudio se sembraron en el medio de cultivo PDA. Después de siete días del proceso de crecimiento e incubación de los hongos fitopatógenos se procedió a determinar los mecanismos de acción in vitro del antagonista. Las cepas de Trichoderma spp. ensayadas in vitro, mostraron antagonismo contra V. dahliae y B. cinerea; en consecuencia, promisorias para su utilización en un programa de control biológico en el Estado de México.

control biológico, patógenos, Rosa sp.

In vitro antagonism of native strains of Trichoderma spp. against Verticilium dahliae and Botritis cinerea in the State of Mexico

ABSTRACT

Rosa sp., is an item of high worldwide demand. In Mexico, it represents one of the most exported ornamentals; however, Verticilium dahliae Kleb., and Botritis cinerea Pers., are among the main phytopathogenic fungi that affect the yields and the quality of the final product in the crop. In the following work, the in vitro antagonism was determined, carried out by native strains of Trichoderma spp. from the State of Mexico, against V. dahliae and B. cinerea. Strains of Trichoderma spp. under study, they were sown in the PDA culture medium. After seven days of the growth and incubation process of the phytopathogenic fungi, the in vitro action mechanisms of the antagonist were determined. Strains of Trichoderma spp. tested in vitro, they showed antago- nism against V. dahliae and B. cinerea; consequently, promising for use in a biological control program in the State of Mexico.

Biological control, pathogens, Rosa sp.

INTRODUCCIÓN

El sector florícola posee una de las industrias más fuertes en muchos países desarrollados y en vías de desarrollo. El cultivo de Rosa sp. constituye el producto ornamental de mayor demanda a nivel mundial (Mackay et al. 2020). En México, la Rosa sp. representa uno de los principales ornamentales que se exporta. En el año 2018, su valor fue de 6.548.916 USD. El Estado de México es el principal productor de Rosa sp. en el país (SIAVI 2019). Las mayores producciones en el cultivo se localizan en la región sur del estado, que incluye los municipios de Tenancingo, Villa Guerrero y Coatepec Harinas (SIAP 2018).

Por otro lado, las enfermedades representan uno de los problemas más serios para la producción de este cultivo. Verticilium dahliae Kleb. y Botritis cinerea Pers., se encuentran entre los principales hongos fitopatógenos que afectan los rendimientos y la calidad del producto final en el cultivo. Estos agentes patógenos ocasionan las enfermedades como la marchitez de la planta y el moho gris de la flor, respectivamente (García-Velasco et al. 2012, 2017). V. dahliae afecta al cultivo de Rosa sp. cuando este se establece en zonas donde previamente se desarrolló algún otro cultivo susceptible, tales como frutales u hortalizas.

Los principales síntomas ocasionados por la enfermedad se observan en la marchitez de las hojas jóvenes y amarillamiento en las hojas inferiores. Posteriormente, se produce marchitez total en la planta. Las hojas presentan un color amarillo que finalmente se tornan a color marrón a medida que se marchitan y mueren. El fitopatógeno puede sobrevivir en el suelo por largos períodos de tiempo (Kenneth y Cloyd 2007). Los daños ocasionados por B. cinerea en el cultivo no ocurren en condiciones de campo y si en el almacenamiento o durante el transpor te. Dentro de los principales síntomas que produce este fitopatógeno se encuentran la presencia de pequeñas manchas marrones en los pétalos, siendo que, las puntas o los lados se vuelven marrones y suaves. Estos síntomas son obvios en los cultivares de Rosa sp. con flores blancas (Kenneth y Cloyd 2007, García-Velasco et al. 2017).

El principal método de manejo que se utiliza para estas enfermedades lo constituye el control químico; aunque, en la región florícola se ha demostrado la pérdida de sensibilidad a algunos fungicidas — tiabendazol, procloraz e iprodiona — (Camacho 2009); y se ha desarrollado resistencia a tiabendazol (López 2019, Manzanos et al. 2019).

Por tal motivo, es necesario la búsqueda de alternativas para lograr la producción sostenible en el cultivo de Rosa sp. de forma sana y segura para la región florícola. En este sentido, la utilización de microorganismos para el manejo de plagas y enfermedades constituye una alternativa viable para asegurar la producción en el cultivo de forma sana. Trichoderma se considera como uno de los antagonistas de hongos fitopatógenos más utilizado en la agricultura moderna sustentable (Youssef et al. 2016, Pineda-Insuasti et al. 2017).

A pesar de que su capacidad como antagonista es altamente variable. Trichoderma spp., tiene potencial como agente de control biológico contra diversos fitopatógenos fúngicos. Los mecanismos antagónicos dependen de la cepa de Trichoderma spp., así como del fitopatógeno, de la planta; y de las condiciones ambientales que incluye la disponibilidad de nutrimentos, el pH y la temperatura. La activación de cada mecanismo implica la producción de compuestos y metabolitos específicos (Benítez et al. 2004, Martínez et al. 2008). Por lo tanto, el éxito en la formulación y comercialización de biopreparados fúngicos mediante la industria biotecnológica para su aplicación en la agricultura requiere de estudios previos en la selección de aislamientos promisorios para el control y del conocimiento de los mecanismos de acción relacionados con dicho control (Pineda-Insuasti et al. 2017).

En trabajos previos, García-Velasco et al. (2021) obtuvieron dos cepas nativas Trichoderma tomentosum (SS1-6) y Trichoderma barbatum (SS2-5) que mostraron ser promisorias para su utilización en el control biológico de Rosellinia necatrix Prill., en el cultivo de Rosa sp., en la región sur del Estado de México.

El presente trabajo se realizó con el objetivo de determinar el antagonismo in vitro de cepas nativas de Trichoderma spp. del Estado de México contra V. dahliae y B. cinerea.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se desarrolló en el laboratorio de Fitopatología del Centro Universitario Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México, México.

Cepas nativas Trichoderma spp.

En la experimentación se utilizaron las cepas nativas de T. tomentosum (SS1- 6) y T. barbatum (SS2-5), identificadas en trabajos anteriores por García-Velasco et al. (2021); también se usaron, las cepas de T. asperellum Samuels (TFR3) y la cepa de T. harzianum Rifai (TA4). Estás últimas fueron identificadas y proporcionadas por el Laboratorio de Fitopatología del Centro Universitario de Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México, México.

Determinación de los mecanismos de acción in vitro de Trichoderma spp. contra los hongos fitopatógenos Verticilium dahliae y Botritis cinerea

Cepas patogénicas

Las cepas patogénicas V. dahliae de y B. cinerea proceden del cepario del Laboratorio de Fitopatología del Centro Universitario de Tenancingo, Universidad Autónoma del Estado de México, México, aisladas de plantas enfermas en el cultivo de Rosa sp., en el municipio de Tenancingo, Estado de México, México. Se realizaron dos ensayos, con cada uno, con una cepa patogénica y las cuatro del antagonista. En el primero, se empleó la cepa de V. dahliae (V.D) combinado con cada una de las cepas de Trichoderma spp. (SS1-6; SS2-5; TFR3 y TA4) sembrados de forma conjunta, conformando cuatro tratamientos, más un testigo correspondiente a V. dalhiae, sembrado de forma aislada en la caja de Petri, y en el segundo ensayo se empleó la cepa patogénica de B. cinerea (TBC2), combinada de manera similar a las antes mencionadas cepas de Trichoderma, también se incluyó el tratamiento testigo, representado por la siembra aislada de B. cinerea (TBC2). Los aislamientos patogénicos y los del antagonistas fueron cultivados en PDA e incubadas a 28±2&nbso;°C, 56 µmol.m-2.s-1 de intensidad luminosa y fotoperiodo de 12/12 —luz/oscuridad—. Después de siete días del proceso de crecimiento e incubación de los hongos mencionados se procedió a realizar de forma separada los ensayos de mecanismos de acción in vitro de Trichoderma spp., que se describen a continuación contra los patógenos V. dahliae (ensayo 1) y B. cinerea (ensayo 2)

Competencia

La competencia entre los microorganismos —patógeno-antagonista- se determinó mediante cultivos duales en cajas de Petri que contenían medio de cultivo PDA según Bell y Markham (1982). Para ello, se tomaron un disco de 8 mm de diámetro de ambos aislamientos V. dahliae-Trichoderma spp. y B. cinerea- Trichoderma spp. Ambos grupos de hongos se sembraron en los extremos de la caja de Petri, a una separación de 6 cm entre ellos. Luego se incubaron según las condiciones anteriormente descritas. Las obser vaciones en el crecimiento de ambos grupos de microorganismos se realizó de forma diaria. A los quince días después del proceso de incubación se determinó la clasificación de antagonismo por medio del pictograma propuesto por Bell y Markham (1982), modificado por Ruiz (2010). Se trazó el área de crecimiento micelial del patógeno para determinar el área de inhibición del crecimiento antagónico. Para ello se tomaron imágenes del reverso de la caja de Petri; y se utilizó el programa Imagen J (versión 1,43) (Schneider et al. 2019)

Antibiosis por metabolitos volátiles

El efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. se determinó mediante la técnica de cajas de Petri superpuestas (Allori et al. 2014). Para ello se sembró un disco de 8 mm de diámetro de cada grupo de hongos de forma independiente en cajas de Petri. Se confrontaron ambos grupos de microorganismos donde se acercaron las dos bases de las cajas de Petri inoculadas con los hongos, separadas con papel celofán estéril. Luego, se sellaron e incubaron en las condiciones descritas. A intervalos de 24 h, después del proceso de incubación se determinó el área de crecimiento micelial del patógeno mediante el programa Imagen J (versión 1,43) (Schneider et al. 2019).

Antibiosis por metabolitos difusibles

El efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. se determinó mediante la técnica de papel de celofán (Dennise y Webster 1971). La técnica empleada consistió en colocar el papel de celofán estéril sobre el medio de cultivo PDA. Posterior a ello, se colocó encima un disco de 8 mm de diámetro de la cepa nativa de Trichoderma spp. a ensayar en la prueba de antibiosis; y se incubaron en las condiciones mencionadas con anterioridad. Luego de 48 h, se eliminó el papel de celofán que contenía el disco del hongo antagonista y se procedió a inocular a los fitopatógenos (V. dahliae y B. cinerea) respectivamente. La incubación del cultivo de los hongos se realizó en las condiciones descritas. En intervalos de 24 h, después del proceso de incubación, se determinó el área de crecimiento micelial del patógeno mediante el programa Imagen J (versión 1,43) (Schneider et al. 2019).

Micoparasitismo

Para determinar el micoparasitismo de las cepas nativas de Trichoderma spp. sobre los patógenos en estudio se utilizó la técnica de microcultivos (Ramírez et al. 2015). A las 72 h del proceso de inoculación e incubación de ambos hongos (patógeno-antagonista) en el interior de la placa de Petri se tomaron imágenes mediante una cámara fotográfica CANNON® integrada a un microscopio CARL ZEISS®. Se consideró micoparasitismo cuando se observó el micelio de las cepas del antagonista tanto en contacto como adherido al micelio del patógeno; de manera similar, al enrollamiento; con la presencia de lisis en las paredes celulares del patógeno y presencia de haustorios del hongo antagonista en las hifas del patógeno (Howell 2003).

Diseño experimental y análisis estadisticos

En la experimentación se utilizó el diseño completo al azar, donde cada tratamiento poseía siete repeticiones, la unidad experimental constituida por una caja de Petri. En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario estadístico InfoStat, versión 2008. En la generalidad de los experimentos se realizaron pruebas paramétricas referidas a análisis de varianza y comparación de promedios, por la prueba de Mínima Diferencia Significativa (LSD) a 5 % de probabilidad.

Análisis estadístico

Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA), de dos vías para los datos que presentaban distribución normal y homogeneidad de varianzas. Se consideró los factores tiempo e inoculación para las variables sobrevivencia y de análisis de crecimiento a través del tiempo. El ANOVA de una vía se aplicó para los análisis de biomasa y análisis de crecimiento puntuales. En todos los casos en que las medias de los tratamientos diferían significativamente se aplicó la prueba de Duncan para P<0,05. Para los análisis se utilizó el programa Statistic 5.5.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación de los mecanismos de acción in vitro de Trichoderma spp. contra los hongos fitopatógenos V. dahliae y B. cinerea

Competencia

Los resultados obtenidos en el crecimiento antagónico de las cepas de Trichoderma spp. —SS1-6; SS2-5; TFR3 y TA4— en el cultivo dual con V. dahliae (ensayo 1) y B. cinerea (ensayo 2). En los primeros días de contacto de V. dahliae, con las cuatro cepas de Trichoderma spp. se observaron diferencias estadísticas significativas (Figura 1). La velocidad de crecimiento fue mayor en la cepa SS1-6, seguido de las cepas TA4, TFR3 ySS2-5. Donde el primer contacto con el patógeno fue en promedio de 4,29; 6,14; 6,57 y 8,2 días después de la siembra de los microorganismos, respectivamente (Figura 1); sin embargo, según la clasificación de antagonismo descrita por Ruíz (2010), las cepas SS1-6, TFR3, TA4 calificaron en la clase 1 con diferencias significativas en relación a la cepa SS2-5 (Cuadro 1). Por otro lado, las cepas, SS1-6, TFR3, TA4 presentaron las mayores áreas de intersección, lo cual correspondió al área total del crecimiento micelial de V. dahliae; mientras que la cepa SS2-5 se clasificó en las clases 2 y 3, demostrando su baja capacidad competitiva, razón por la cual no crece sobre el patógeno. Por otra parte, en el área de crecimiento micelial las cuatro cepas probadas mostraron diferencias significativas con respecto al tratamiento testigo. Donde se lograron los siguientes porcentajes de inhibición: 70,6 % (cepa TFR3); 67,5 % (cepa TA4); 59,5 % (SS1-6); y 49,1 % la cepa SS2-5 (Cuadro 1).

Crecimiento antagónico Trichoderma
Figura 1. Efecto del crecimiento antagónico de las cepas de Trichoderma spp. en el cultivo dual con los hongos fitopatógenos V. dahliae y B. cinerea. Barras de error corresponden al valor crítico de la prueba LSD (p≤0,05).

En el crecimiento antagónico de las cepas de Trichoderma spp. en el cultivo dual con B. cinerea se observó el primer contacto entre el antagonista y el patógeno; a partir del tercer día del proceso de inoculación; en los tratamientos con las cepas SS1-6, TA4 y la cepa TFR3; hubo diferencias significativas marcadas respecto al tratamiento con la cepa SS2-5 (Figura 1); mientras que, en la clasificación de antago- nismo las cepas SS1-6; TFR3 y la TA4 sobrecrecieron de forma completa al patógeno. Razón por la cual se encontraron en la clase 1; y por lo tanto presentaron la mayor área de intersección con B. cinerea (Cuadro 2). Por otro lado, la cepa SS2-5 se clasificó entre las clases 2 y 4 donde el agente patógeno creció menosde 2/3 partes; y el antagonista no lo colonizó, lo cual evidencia su baja habilidad competitiva (Figura 1).

En el crecimiento micelial del patógeno se encontraron los mayores valores en el tratamiento testigo (34,16 cm2); con diferencias significativas con el resto de los tratamientos; sin embargo, los mayores porcentajes de inhibición en el crecimiento de B. cinerea se obtuvieron en las cepas TFR3 (67,7 %); SS1-6 (67,2 %); y en la cepa TA4 (65,8 %) (Cuadro 1).

Cuadro 1. Determinación del área de crecimiento micelial de Verticillium dahliae y Botrytis cinerea en cultivos duales con Trichoderma spp., después de los quince días de la inoculación de ambos microorganismos.
Verticillium dahliae Botrytis cinerea
Cepas nativas Clasificación de antagonismo Área de intersección (cm2) Crecimiento micelial (cm2) Inhibición (%)* Clasificación de antagonismo Área de intersección (cm2) Crecimiento micelial (cm2) Inhibición (%)*
SS1-6 1,00 a 2,07 b  2,07 a 59,5 1,00 a 11,22 b 11,22 a 67,2
SS2-5 2,86 b 0,26 a 2,60 a 49,1 3,14 b   2,70 b 19,36 b 43,3
TFR3 1,00 a 1,50 b 1,50 a 70,6 1,00 a 11,05 b 11,05 a 67,7
TA4 1,00 a 1,66 b 1,66 a 67,5 1,00 a 11,67 b 11,67 a 65,8
Testigo No aplica No aplica 5,11 b No aplica No aplica No aplica 34,16 c No aplica
Cifras con diferente literal indican diferencias estadísticas significativas por la prueba LSD a 5 % de probabilidad; *en relación al testigo.

La capacidad como antagonista de Trichoderma depende de la especificidad de la cepa, y de los mecanismos de acción. Por tal motivo, es imprescindible la selección de aislamientos promisorios para el control de agentes patógenos, lo cual incluye el estudio de los mecanismos relacionados con dicho control (Sivila y Jujuy 2013). Entre estos mecanismos se encuentra el de competencia por espacio y nutrimentos. El cual se ve favorecido por la alta velocidad de crecimiento que posee gran parte de sus aislamientos y la secreción de metabolitos de diferente naturaleza, que frenan o eliminan a los competidores en el microambiente (Rajesh et al. 2016). Por otro lado, la competencia evaluada bajo condiciones in vitro (cultivo dual), se ejerce principalmente por espacio y en ella intervienen la velocidad de crecimiento de las cepas del antagonista y factores externos como tipo de sustrato, pH y temperatura entre otros (Martínez et al. 2013).

En este sentido, Xiojun et al. (2014) obtuvieron 33 aislados de Trichoderma spp. en el cultivo de la papa (Solanum tuberosum) en China, el estudio de su antagonismo in vitro con V. dahliae, indicó porcentajes de inhibición de crecimiento micelial comprendidos entre 24,7 a 38,3 %. Por otra parte, Jiménez et al. (2009) plantean que la aplicación de un producto comercial (Bioten®) que contiene T. asperellum y T. gamsii redujo en 30 % la severidad de síntomas causados por V. dahliae en el cultivo de olivo (Olea europea L); mientras que, Villalpando et al. (2016) demostraron que 11 aislados de Trichoderma spp. obtenidos en Argentina inhibieron el crecimiento de B. cinerea en un intervalo de 46 % a 36 % en cultivos duales.

Antibiosis por metabolitos volátiles

El efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas de Trichoderma spp. se evidenció en las cepas SS1- 6 y SS2-5; con marcadas diferencias respecto al resto de los tratamientos (Cuadro 2); aunque, el mayor porcentaje de inhibición del crecimiento micelial de V. dahliae se observó en la cepa SS2-5 (46,8 %). Resultados similares fueron observados en el efecto de los metabolitos volátiles de Trichoderma spp.; pero, en el crecimiento micelial de B. cinerea donde los mejores resultados se observaron para las cepas SS1-6 y SS2-5 con diferencias marcadas respecto a las cepas TFR3; TA4 y el tratamiento testigo. El mayor porcentaje de inhibición del patógeno se observó en la cepa SS1-6—65,2 %— (Cuadro 2).

Cuadro 2. Efecto de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. contra Verticillium dahliae y contra Botrytis cinerea.
Cepas nativas Verticillium dahliae Botrytis cinerea
Crecimiento micelial (cm2) Inhibición (%) Crecimiento micelial (cm2) Inhibición (%)
SS1-6 3,94 a 42,9 13,92 a 65,2
SS2-5 3,67 a 46,8 16,68 b 58,3
TFR3 5,92 b 14,2 37,95 c 5,2
TA4 6,36 bc 7,8 25,62 b 36
Testigo 6,90 c No aplica 40,04 c No aplica
Cifras con diferente literal indican diferencias estadísticas significativas por la prueba LSD a 5 % de probabilidad; *en relación al testigo.

Los metabolitos con actividad antifúngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de compuestos volátiles y no volátiles, muy diverso en cuanto a estructura y función; también inhiben el desarrollo de otros microorganismos con los que no hacen contacto físico y tales sustancias inhibidoras son consideradas antibióticos (Infante et al. 2009). De manera análoga, Vinale et al. (2006) afirman que algunas cepas de Trichoderma spp. producen trichodermina, dermadina, suzukacilina, viridina, alameticina, richotoxina, metabolitos que son responsables del mecanismo antagónico. Fernandes et al. (2013) evaluaron el antagonismo y la producción de enzimas hidrolíticas de cuatro especies de Trichoderma contra varios patógenos de plantas entre ellos: Fusarium solani, Rhizoctonia solani y Sclerotinia sclerotiorum. Los resultaros mostraron que las especies T. harzianum y T. asperellum fueron los antagonistas más efectivos contra los patógenos de plantas probados. Se agrega, que la mayoría de las especies de Trichoderma probadas produjeron metabolitos volátiles tóxicos con efectos significativos en la inhibición del crecimiento y desarrollo de los patógenos vegetales mencionados.

Antibiosis por metabolitos difusibles

El efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por las cepas de Trichoderma spp. se observó más marcado en las cepas SS1-6 y SS2-5; con diferencias significativas en relación al resto de los tratamientos (Cuadro 3). Donde se logró un área de crecimiento micelial del patógeno de 4,41 cm2 con la cepa SS1-6; aunque, el área de crecimiento micelial de V. dahliae fue de 4,12 cm2 con la cepa SS2-5. Los mayores porcentajes de inhibición del patógeno se obtuvieron en los tratamientos con las cepas SS1-6 (48.8 %); y SS2-5 (52.1 %) con diferencias marcadas al resto de los tratamientos evaluados. De manera similar, se encontró efecto de los metabolitos difusibles en relación al porcentaje de estimulación en las cepas TFR3 (32,63 %) y TA4 (37,5 %) con diferencias marcadas al resto de las cepas estudiadas y al tratamiento testigo; sin embargo, no se encontraron diferencias entre los tratamientos en el efecto de los metabolitos difusibles de las cepas de Trichoderma spp., en relación al crecimiento micelial de B. cinerea.

Cuadro 3. Efecto de los metabolitos difusibles con actividad antifúngica secretados por las cepas nativas de Trichoderma spp. contra Verticillium dahliae y contra Botrytis cinerea.
Cepas nativas Verticillium dahliae Botrytis cinerea
Crecimiento micelial (cm2) Inhibición (%) Estimulación (%) Crecimiento micelial (cm2) Inhibición (%) Estimulación (%)
SS1-6 4,41 a 48,8 0 37,68 ab 7,3 0
SS2-5 4,12 a 52,1 0 30,16 a 25,8 0
TFR3 11,42 c 0 32,63 46,90 b 0 15,4
TA4 11,84 c 0 37,5 41,41 ab 0 1,9
Testigo 8,61 b No aplica No aplica 40,65 ab No aplica No aplica
Cifras con diferente literal indican diferencias estadísticas significativas por la prueba LSD a 5 % de probabilidad; *en relación al testigo.

El mayor porcentaje de inhibición se logró con la cepa SS2-5 (25,8 %). En la estimulación del crecimiento los mayores porcentajes se encontraron en las cepas TFR3 (15,4 %) y TA4 (1,9 %) (Cuadro 3). Martínez et al. (2008) plantean que la desactivación de los factores de patogenicidad de Trichoderma spp. contra hongos fitopatógenos constituye un mecanismo de antagonismo indirecto poco estudiado; sin embargo, Howell (2003) explica que es posible que el potencial enzimático de Trichoderma spp. actúe como antibiótico para detener el proceso infeccioso de los patógenos. Harman (2000) planteó que T. viride Pers produce glucosidasa para degradar una fitotoxina de Rhizoctonia solani Kühn.

Micoparasitismo

Las cepas SS1-6, TFR3 y TA4 mostraron simbiosis del tipo parasítica. En la cepa SS1-6 se observó una interacción muy estrecha con el micelio de V. dahliae, lo cual se manifestó por medio de adhesión de las hifas y enrollamiento (Figura 2). Las cepas TFR3 y TA4 reconocieron al patógeno y se adhirieron al mismo (Figuras 3 y 4); mientras que en el tratamiento con la cepa TA4 se evidenció la penetración del micelio de V. dahliae por medio de haustorios (Figura 3).

Micoparasitismo T. tomentosum
Figura 2. Micoparasitismo de T. tomentosum (cepa nativa SS1-6) en el patógeno V. dahliae. A: reconocimiento y adhesión del micelio de T. tomentosum al patógeno (Vd) (40x). B: enrollamiento del antagonista al micelio de V. dahliae, 100x.
Micoparasitismo T.harzianum
Figura 3. Micoparasitismo de T. harzianum (cepa TA4) en el patógeno V. dahliae. A, B y D: crecimiento adyacente de T. harzianum que forma haustorios (H) de penetración para alimentarse del patógeno (Vd) (100x). C: adhesión del antagonista (TA4) al micelio de V. dahliae, 40x.
Micoparasitismo T.asperellum
Figura 4. Micoparasitismo de T. asperellum (cepa TFR3) en el patógeno V. dahliae. A y B: reconocimiento y adhesión del micelio del antagonista al micelio de V. dahliae (Vd), 40x.

El micoparasitismo constituye el principal mecanismo antagonis ta mos tr ado por Trichoderma. Este inicia cuando el hongo antagonista reconoce al hospedador y se une a las hifas por apresorios. Luego, degrada la pared celular secretando enzimas, en especial la quitinasa y la β-1, 3-glucanasas, celulasas, proteasas y fosfatasas (Qualhato et al. 2013). En los ensayos de confrontamiento, Peláez et al. (2016) mostraron la capacidad de T. asperellum (T8a) para inhibir el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides (ATCCMYA456) en 91  %; alcanzado a través de mecanismos micoparasíticos observando un sobrecrecimiento en el hongo fitopatógeno, por la cepa T8a evidenciando la capacidad antagonista como alternativa promisoria de control de origen microbiano contra el agente causal de la antracnosis en el mango (de los Santos-Villalobos et al. 2013). Martínez et al. (2020), en las cepas T1 y T2 de T. harzianum demostraron microscópicamente los mecanismos de micoparasitismo sobre ocho cepas de fitopatógenos. El compor tamiento micoparasítico observado en la cepa SS1-6 ha sido evidenciado para el género Trichoderma (estado teleomorfo: Hypocrea). La capacidad de micoparasitar mediante la biosíntesis de enzimas líticas se ha utilizado de forma amplia para la protección de plantas contra diversas enfermedades fúngicas (Atanasova et al. 2013).

El micoparasitismo de Trichoderma spp. sobre B. cinerea se evidenció en todas las cepas del microorganismo antagonista. Se observó contacto micelial, lo cual provocó la adhesión y penetración de haustorios al micelio de B. cinerea (Figura 5 y 7). Las cepas SS1-6 y la TA4 mostraron super enrollamiento al micelio del patógeno (Figura 5 y 6).

Micoparasitismo T. tomentosum
Figura 5. Micoparasitismo de T. tomentosum (cepa nativa SS1-6) en el patógeno B. cinereaB. A y C: formación de haustorios (H) por el antagonista para alimentarse del patógeno (Bc), y ocasionarle la muerte. B: adhesión del micelio del antagonista (SS1) al micelio de B. cinerea (Bc). D: enrollamiento de T. tomentosum al micelio del patógeno (Bc), 100x.
Micoparasitismo Th
Figura 6. Micoparasitismo de T. harzianum (TA4) en B. cinerea. A: enrollamiento al micelio del patógeno (40 x). B: penetración (P) al micelio de B. cinerea (100x). C: reconocimiento y adhesión del micelio al micelio del patógeno (100x). D: enrollamiento y absorción del contenido celular (A) del micelio de B. cinerea (40x).
Micoparasitismo T. asperelum
Figura 7. Micoparasitismo de T. asperellum (cepa TFR3) en el patógeno B. cinerea. A y B: crecimiento y formación de haustorios de penetración (H). C y D: crecimiento y adhesión al micelio del patógeno, 100x.

CONCLUSIONES

Las cepas de Trichoderma spp. ensayadas mostraron antagonismo contra V. dahliae y B. cinerea, siendo promisorias para su utilización en un programa de control biológico en el Estado de México.

En el cultivo dual, la cepa SS1-6 mostró el mayor efecto antagónico hacia V. dahliae; mientras que, las cepas SS1-6, TA4 y la TFR3, lo fueron frente a B. cinerea.

Los efectos de los metabolitos volátiles con actividad antifúngica secretados por las cepas de Trichoderma spp. se evidenciaron en las cepas SS1-6 y SS2-5, para ambos patógenos.

El mecanismo de micoparasitismo estuvo presente en todas las cepas estudiadas de Trichoderma, para ambos patógenos.

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