Comparación de tres métodos para la determinación de coliformes totales en canales de pollos provenientes de una planta beneficiadora en el estado Carabobo, Venezuela

Comparison of three methods for the determination of total coliforms in chicken carcasses from a slaughterhouse in Carabobo state, Venezuela

INTRODUCCIÓN

La carne de pollo es un alimento ampliamente consumido por la población y representa aproximadamente dos tercios de la producción total de carne alrededor del mundo en la actualidad (Albarri et al. 2017). Se le considera un vehículo importante de enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA) y ocupa entre el primero y el segundo lugar en alimentos asociados con ETA (Sams 2001). Lo anterior puede ser facilitado por sus particularidades fisicoquímicas tales como pH cercano a la neutralidad, actividad de agua alta, y alto contenido de proteínas y grasas (Mercado et al. 2012). Estas características promueven la susceptibilidad de este producto a la contaminación con diversos microorganismos, tales como las bacterias coliformes, que pueden contaminar la carne de pollo durante los procesos de beneficio.

Se han reportado múltiples y variadas fuentes de posible contaminación de la carne de pollo, tales como el tracto intestinal o la materia fecal presente en las patas o plumas del animal (Albarri et al. 2017). De igual forma, Marques et al. (2017) reportan que, en condiciones de producción, comercialización y manipulación inadecuadas, patógenos como Salmonella spp. y Escherichia coli, surgen como responsables de numerosos brotes de ETA, tanto en países desarrollados como en países con recursos limitados.

Lo anterior indica los riesgos del consumo de carne de pollo en caso de contaminación del producto, con las subsiguientes implicaciones para la salud pública. Esto ha provocado que la industria alimentaria se esfuerce en garantizar el control de la calidad sanitaria durante el procesamiento industrial, a fin de minimizar los riesgos para la salud del consumidor, contribuir a la comercialización de productos inocuos (Kim et al. 2017), y evitar pérdidas económicas por la contaminación microbiológica en las plantas beneficiadoras (Degli et al. 2018).

Para la evaluación de calidad sanitaria durante el procesamiento de las aves de corral, se ha reportado el uso de indicadores bacterianos como los recuentos de coliformes totales y los recuentos de bacterias aeróbicas. Los primeros son utilizados como un indicador de higiene en el monitoreo de los procedimientos de sacrificio y en la evaluación de la eficiencia del escaldado, flameado, evisceración y enfriamiento. Mientras que los recuentos bacterianos constituyen un indicador de las condiciones higiénicas generales (Saad et al. 2015, Szczech et al. 2018).

Estudios recientes evidencian que un alto número de coliformes pueden indicar la presencia de patógenos intestinales como E. coli (Pacheco et al. 2017). De igual forma, Li et al. (2019) reportaron que los mismos pueden considerarse buenos indicadores de patógenos entéricos como Salmonella y E. coli en productos avícolas. Es oportuno destacar que aun cuando la mayoría de los aislados de E. coli no son patógenos, aproximadamente entre 10 a 15 % de los coliformes intestinales son oportunistas patógenas, por lo que son responsables de una variedad de lesiones en huéspedes inmunocomprometidos. Además, pueden estar asociados con enfermedades graves y en algunas ocasiones, con infecciones letales como meningitis, endocarditis, infección del tracto urinario, septicemia y diarrea epidémica de adultos y niños (Uddin et al. 2019).

Aunque el consumo de la carne de pollo se realiza posterior a la cocción, es oportuno resaltar que altas temperaturas de cocción no garantiza la inocuidad del producto. Se ha reportado que algunas bacterias o sus metabolitos pueden ser resistentes al proceso de cocción, como las bacterias termo-tolerantes pertenecientes al género Campylobacter (García et al. 2017) o enterotoxinas producidas por Staphylococcus aureus, las cuales han sido relacionadas con ETA causadas por aves de corral (Firildak et al. 2015).

En Venezuela, son escasos los estudios de evaluación de parámetros microbiológicos en carnes de aves como el pollo, por lo que no se cuentan con datos suficientes que permitan inferir la calidad sanitaria de los procesos asociados a la producción de pollos en el país.

Para la industria avícola nacional e internacional existen dos aspectos de particular importancia, el primero es la determinación de la calidad sanitaria de la canal a lo largo del proceso de producción; el segundo es contar con metodologías confiables y rápidas que permitan la liberación oportuna de sus productos bajo criterios microbiológicos que garanticen la inocuidad del alimento, y que sea apto para el consumo humano (Dušková et al. 2016). En relación al segundo aspecto, es necesario contar con las técnicas más adecuadas y rentables para la evaluación microbiológica de los pollos de consumo.

Considerando lo antes expuesto, el objetivo de este estudio fue comparar la eficiencia de tres métodos analíticos (NMP, VP, Petrifilm™) para la detección de la contaminación microbiológica por coliformes totales en pollos provenientes de una planta beneficiadora en el estado Carabobo, Venezuela.

MATERIALES Y MÉTODOS

Lugar de muestreo

La muestra fue obtenida en una planta de beneficio de pollos ubicada en el estado Carabobo, Venezuela. Esta empresa realiza evaluaciones periódicas del proceso de beneficio, para el control higiénico sanitario del mismo.

Muestra

Se realizó un muestreo exploratorio al azar durante 27 días continuos, de acuerdo a las recomendaciones establecidas en la Norma Venezolana COVENIN 1126 (COVENIN 1989). En cada día de muestreo se colectaron 3 pollos beneficiados tipo grado “A”, con un promedio de peso de 1,8 kg, refrigerados y empacados en bolsas individuales. Los mismos fueron transportados al laboratorio de microbiología de la empresa, en recipientes isotérmicos con hielo para su procesamiento inmediato.

En concordancia con la Norma Venezolana COVENIN 2343 (COVENIN 1986), la unidad de análisis de cada pollo beneficiado consistió en una muestra de tejido muscular libre de grasa de las zonas del muslo (músculo iliotibial craneal derecho e izquierdo) y pechuga (músculo pectoral torácico derecho e izquierdo). Un total de 25 g por pollo se utilizaron en la primera dilución, homogeneizados en 225 mL de agua peptonada al 0,1 % (dilución 1/10).

Determinación de coliformes totales

A partir de la primera dilución, cada una de las muestras fue inoculada en una serie de tubos con diluciones en agua peptonada al 0,1 %. Los ensayos se realizaron por triplicado mediante los siguientes métodos:

• Método del número más probable (NMP)

Se realizó de acuerdo a la norma venezolana COVENIN 1104 (COVENIN 1996). Para esto se inoculó 1 mL de cada dilución en 3 tubos de ensayo de 9 mL con campana de Durham, contentivo de caldo Mac Conkey (BBL™ Becton Dickinson and Company. Sparks, MD USA). Se incubaron a 37°C por 24 h. Luego de este periodo, se agitó suavemente cada tubo y se observó la aparición de gas y turbidez, ambas apreciaciones indicaron presencia de coliformes totales. Se cuantificó el resultado utilizando la tabla de probabilidad para diluciones en tubo (NMP para tres tubos), de acuerdo a ISO (1991).

• Vertido en placa (VP)

Se inoculó 1 mL de cada dilución en 2 placas Petri mediante la siembra en profundidad en Agar Bilis Rojo Violeta (HIMEDIA®, Himedia laboratories, Mumbai, India), con posterior incubación a 37 ºC por 24 h, de acuerdo a la metodología estándar sugerida por la norma COVENIN 1086 (COVENIN 1984). Las colonias se enumeraron al término del tiempo de incubación, en cuenta colonias tipo Quebec, considerando para el recuento únicamente las placas que tenían entre 1 y 150 colonias. El resultado expresado corresponde al número de unidades formadoras de colonias por mililitro de muestra (UFC.mL^-1).

• Petrifilm™

El procedimiento consistió en colocar 1 mL de las diluciones en el centro de la película cuadricular inferior, para luego ubicar sobre la placa, el difusor. Se presionó suavemente para distribuir el inóculo sobre el área y se esperó 1 min para hidratar el gel. Las placas fueron incubadas durante 48 h a 35 °C (de acuerdo con la metodología estándar sugerida por la norma COVENIN 3276 (COVENIN 1997). Las colonias se enumeraron al término del tiempo de incubación, en cuenta colonias tipo Quebec, considerando para el recuento únicamente las placas que tenían entre 15 y 150 colonias. El resultado expresado corresponde al número de bacterias o unidades formadoras de colonias por mililitro de muestra (UFC.mL^-1).

Definición del límite de aceptabilidad

En Venezuela no se encuentra definido el límite de aceptabilidad para coliformes totales en pollo, por tanto se utilizaron como límites microbiológicos, los valores dispuestos en las normas vigentes en otros países latinoamericanos tales como Argentina, Nicaragua y Perú (Molina et al. 2010), considerado como rechazables aquellos recuentos mayores a 1000 UFC.mL^-1 o NMP.mL^-1 (mayor a 3 log₁₀UFC.mL^-1) y aceptables, los recuentos menores a 1000 UFC.mL^-1 o NMP.mL^-1(menor a 3 log₁₀UFC.mL^-1).

Análisis estadístico

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Cuantificación de coliformes totales

La cuantificación de coliformes totales en las canales de pollo analizadas se muestra en el Cuadro 1. De manera específica, el método NMP detectó valores por encima de 3,04 unidades logarítmicas (log₁₀NMP.mL^-1), en 63,75 % de las muestras. Para los métodos Petrifilm™ y VP, una mayor proporción de muestras presentaron recuentos entre las 2,01 y 4,01 unidades logarítmicas, con frecuencias de 75,5 y 73,75 %, respectivamente.

Las bacterias coliformes son indicadores de contaminación por enterobacterias, esto significa que su hallazgo revela la presencia de patógenos intestinales como E. coli y Salmonella spp. Con base en lo anterior, la determinación de coliformes totales constituye un parámetro importante en la evaluación de las condiciones sanitarias del procesamiento y almacenamiento del pollo (Pacheco et al. 2017).

Los resultados del presente estudio muestran que independientemente del método utilizado, los recuentos de coliformes se concentraron en un rango similar (entre 2 y 4 unidades logarítmicas). Lo anterior coincide con los estudios realizados por Molina et al. (2010), quienes describieron rangos similares o superiores para muestras de pollo crudo aliñado y sin aliñar, expendidos en diferentes supermercados de Mérida (Venezuela). Así mismo, Ibrahim et al. (2015) señalaron recuentos de coliformes muy parecidos a los reportados en el presente estudio (3,1 unidades logarítmicas), en muestras de canales de pollo (sacrificadas, desplumadas y evisceradas) provenientes de tiendas minoristas de varias ciudades de Egipto.

Investigaciones realizadas por Acevedo et al. (2015) utilizando la técnica de NMP, reportaron valores por encima de las 7 unidades logarítmicas en muestras de pechuga de pollo provenientes de varios mercados de Colombia. Otros trabajos realizados en la India y Kenia, señalan recuentos ubicados entre 4 y 7 unidades logarítmicas para muestras de carne de pollo recolectadas de diferentes avícolas, utilizando las técnicas de vertido en placa y Petrifilm™ (Odwar et al. 2014, Kumar y Verma 2016).

Comparación de los métodos analíticos

Se observaron diferencias significativas (P < 0,05) entre los métodos NMP y VP (P = 0,0126), mientras que entre los métodos NMP y Petrifilm™, no existieron diferencias (P = 0,6547). Estos resultados muestran que el método Petrifilm™ es tan útil como el NMP para su empleo de rutina en la industria de alimentos, debido a la inexistencia de diferencia significativa entre ambos métodos. En un estudio realizado por Samarajeewa et al. (2010), no se detectaron diferencias significativas entre el método de Petrifilm™ y el método NMP para la recuperación de E. coli a partir de muestras ambientales de suelo. Ambas pruebas se basan en la actividad de la enzima β-D-glucoronidasa, presente en E. coli en un 94 %. Los resultados del presente estudio coinciden con los reportados por Rahman et al. (2012), quienes compararon el método de NMP y el Petrifilm™ para la detección de E. coli en muestras de aves de corral. Estos investigadores obtuvieron resultados similares en términos de precisión y correlación, siendo el método de Petrifilm™ uno de los métodos más prácticos.

Sensibilidad y especificidad

La relación sensibilidad-especificidad del método Petrifilm™ es mayor a la de VP (Figura 1), lo que confirma la mayor confiabilidad de Petrifilm™ como método alternativo para la determinación de coliformes totales en las muestras de pollo, sobre el NMP tradicional. En relación a lo anterior, estudios diferentes han resaltado la reproducibilidad de los resultados y los altos valores de sensibilidad y especificidad de las placas Petrifilm™ en comparación con los métodos tradicionales (Casillas et al. 2012, Hervert et al. 2017). Por otra parte, en el trabajo de Drebes et al. (2012) se observó la detección directamente proporcional del microorganismo de interés, en un rango de concentración de 1 a 256 UFC.mL^-1. Con base en estos resultados, los investigadores resaltaron la sensibilidad del método Petrifilm™ para la detección de niveles bajos de microorganismos en canales de aves de corral y la factibilidad de su uso como prueba de rutina en los laboratorios de la industria alimentaria, o incluso para laboratorios de salud pública.

Grado de aceptabilidad

Los resultados obtenidos en relación a la aceptabilidad se muestran en el Cuadro 2. En la mayoría de las muestras, se detectaron niveles de coliformes totales superiores a los límites microbiológicos establecidos en las normativas de Argentina, Nicaragua y Perú, que se corresponden a los rangos: 2,0 - 2,69; 2,70 – 3,0 y 0 - 2,0 Log₁₀UFC.g^-1, respectivamente. (Molina et al. 2010)

Aunque en Venezuela no se encuentra definido el límite de aceptabilidad para coliformes totales, los valores obtenidos independientemente del método de detección, indicaron que la mayoría de los productos se consideraron rechazados al observarse una proporción importante de muestras positivas (entre el 58 y 71 %) por encima del límite permitido. Estos resultados coinciden con el trabajo realizado por Pacheco et al. (2017), quienes reportaron recuentos en las etapas minorista y consumidor, en el 72,2 y 94,4 % de las muestras analizadas, respectivamente. Estos valores excedieron los límites máximos de coliformes totales.

De igual manera, Odwar et al. (2014), reportaron que un 76 % de las muestras estuvieron por debajo del rango aceptable para coliformes totales. Esto indica, al igual que en la presente investigación, fallas higiénicas durante el procesamiento y almacenamiento del pollo beneficiado. Los recuentos de coliformes totales por encima del límite permitido de aceptabilidad, indican la necesidad de establecer medidas correctivas desde el punto de vista higiénico-sanitario durante todas las etapas del procesamiento industrial, desde el sacrificio hasta la comercialización (Pacheco et al. 2017). Se ha demostrado la relación entre la deficiente calidad sanitaria y la presencia de patógenos entéricos, los cuales constituyen un riesgo para la salud de los consumidores (Ibrahim et al. 2015).

Finalmente, para garantizar la inocuidad de los productos alimenticios se requiere de métodos más eficientes y confiables a los fines de realizar una evaluación eficaz de estos productos. La calidad sanitaria del alimento tiene incidencias sobre varios aspectos, en primer lugar asegura la calidad y la inocuidad de los productos y procesos, disminuye las potenciales pérdidas asociadas al deterioro y decomiso de productos, además promueve la satisfacción del cliente.

De igual forma, Petrifilm™ permite mayor rapidez en la obtención de resultados comparado al método NMP, que requiere al menos 5 días. Esto indica que NMP es el menos adecuado para el análisis diario del producto (Teramura et al. 2017). Este último aspecto es de particular importancia para la industria avícola, que requiere la emisión rápida de resultados para la liberación oportuna de los productos alimenticios, con criterios microbiológicos que garanticen la inocuidad de los mismos.

En la actualidad, la metodología Petrifilm™ podría considerarse costosa, comparada con NMP y VP. No obstante, estas metodologías requieren la adquisición de placas y medios de cultivo que puede resultar en un mayor gasto para las empresas. Con base a los datos presentados en este estudio, se demuestra la factibilidad del uso de Petrifilm™ para la determinación de coliformes totales en canales de pollo beneficiado grado “A”, debido a su rapidez, confiabilidad, practicidad y rentabilidad.

CONCLUSIONES

El método Petrifilm™ permitió la determinación de coliformes totales en muestras de pollo beneficiado grado “A”, de una manera rápida, rentable y confiable.

Los resultados del presente estudio permiten inferir que el método Petrifilm™ constituye una técnica alternativa al NMP en la determinación de coliformes totales en muestras de pollo.

Los resultados obtenidos en la determinación de coliformes totales mostraron un porcentaje de aceptabilidad bajo (entre 28 y 42 %), independientemente del método utilizado. Lo anterior evidencia una deficiente calidad sanitaria del pollo beneficiado que podría coincidir con la presencia de patógenos entéricos, situación que representa un riesgo de salud para los consumidores. Se recomienda intensificar los controles higiénico-sanitarios, así como la adopción de buenas prácticas de manufactura en toda la cadena alimentaria.